Cambios proteómicos de fibroblastos y células endoteliales tras la incubación con cuerpos densos subvirales del citomegalovirus humano

Datos científicos volumen 10, número de artículo: 517 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

El citomegalovirus humano (HCMV) es un patógeno de gran relevancia médica. Los cuerpos densos subvirales (DB) se desarrollaron como una vacuna candidata para mejorar las graves consecuencias de la infección por HCMV. El desarrollo de una vacuna candidata de este tipo para aplicación humana requiere un conocimiento detallado de su interacción con el huésped. Se realizó un análisis completo basado en espectrometría de masas (MS) con respecto a los cambios en el proteoma de células de cultivos celulares expuestas a DB.

El citomegalovirus humano (HCMV) es un β-herpesvirus y la principal causa de infecciones congénitas en todo el mundo, provocando una serie de secuelas como pérdida de audición, déficit visual o trastornos cognitivos1. En el contexto de inmunosupresión sistémica, la infección por HCMV puede provocar una morbilidad y mortalidad sustanciales1. Los fibroblastos infectados con HCMV liberan grandes cantidades de partículas no infecciosas, denominadas cuerpos densos, en el sobrenadante del cultivo celular2,3. Los análisis de espectrometría de masas de DB aislados han contribuido a dilucidar su composición proteica y han revelado la presencia de importantes antígenos de la respuesta inmune adaptativa contra HCMV4,5. Mientras tanto, experimentos in vitro y estudios en animales demostraron que los DB son notablemente inmunogénicos e inducen una fuerte respuesta de interferón (IFN)6,7,8,9,10,11. En consecuencia, la DB se ha considerado una vacuna prometedora contra el HCMV12,13. Con respecto a la aplicación en humanos de una vacuna candidata en ensayos clínicos y para la concesión de la licencia definitiva, es importante tener un conocimiento exhaustivo sobre el impacto de la vacuna en las células huésped para evaluar los posibles efectos adversos y la tolerabilidad. Se generaron conjuntos de datos sobre el impacto de la DB en los fibroblastos en cultivo y las células endoteliales mediante espectrometría de masas (MS). Estos conjuntos de datos se utilizaron en una publicación anterior que se centró en la investigación de la respuesta al interferón-β y la inducción de la expresión del gen estimulado por interferón (ISG) en fibroblastos y células endoteliales tras la exposición a DB11.

Los fibroblastos primarios de prepucio humano (HFF) se establecieron a partir del prepucio de un niño recién nacido en 1994 y se utilizaron para investigaciones en el pasado6,7,14,15,16. La aprobación para utilizar estas células para los estudios se obtuvo del comité de ética del consejo médico de Renania-Palatinado, Alemania. Los HFF se mantuvieron en medio mínimo esencial (MEM; Gibco-BRL, Glasgow, Escocia) suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 5%, L-glutamina 100 mg/l, factor de crecimiento de fibroblastos básico 0,5 ng/ml (bFGF, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y gentamicina (5 mg/l). Para los experimentos, se utilizaron números de pases de células HFF entre 16 y 19. Las células HEC-LTT fueron establecidas por Dagmar Wirth y compañeros de trabajo17. Las células se derivaron de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) que se inmortalizaron condicionalmente con expresión dependiente de tetraciclina del antígeno T grande SV40 y la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT). Para el cultivo, los recipientes de cultivo se recubrieron con gelatina al 0,1% (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) durante al menos 30 minutos. Las células HEC-LTT se mantuvieron en medio de crecimiento endotelial (EGM BulletKit; Lonza Sales Ltd., Basilea, Suiza) suplementado con 2 μg/ml de doxiciclina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). La proliferación de células HEC-LTT puede controlarse con doxiciclina (DOX). La adición de DOX activa la expresión de las proteínas inmortalizantes hTERT y el antígeno T grande SV40, lo que da como resultado la proliferación celular. La doxiciclina se omitió durante todos los experimentos. El permiso para utilizar células HEC-LTT con fines de investigación se otorgó mediante un acuerdo de transferencia de material por parte del Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones (HZI). Se demostró que las células eran permisivas a la infección por HCMV18. Christian Sinzger (Instituto de Virología, Centro Médico de la Universidad de Ulm, Ulm, Alemania) nos envió amablemente HEC-LTT y los utilizamos para experimentos desde el pasaje 41 al pasaje 55.

Se prepararon reservas de semillas de virus a partir de sobrenadantes de HFF transfectados. Brevemente, la cepa Towne-repΔGFP (en lo sucesivo denominada TR-∆GFP) se reconstituyó mediante transfección de ADN del cromosoma artificial bacteriano (BAC), que contiene el genoma de Towne-repΔGFP en HFF. La generación del clon BAC fue descrita por Lehmann et al.7. Las células transfectadas se propagaron hasta que el 100% de las células mostraron efectos citopáticos (CPE). Los sobrenadantes que contenían virus de estos cultivos se recolectaron y se eliminaron previamente de los desechos celulares mediante centrifugación a 1475 × g durante 10 minutos y luego se almacenaron como reservas de semillas de virus a -80 °C para una mayor propagación del virus.

Se prepararon reservas experimentales de virus a partir de sobrenadantes de HFF, infectados con reservas de semillas de virus. Para ello, se sembraron HFF a una densidad de 1,8 × 106 en cinco matraces de cultivo de tejidos de 175 cm2 y se infectaron con 5 ml de inóculo de virus por matraz. Para esto, se mezclaron 1 ml del sobrenadante de la semilla TR-∆GFP y 4 ml de medio MEM al 5% y se agregaron a las células durante 1,5 horas. Luego se agregaron 15 ml de medio MEM fresco al 5% y las células infectadas se incubaron a 37 °C hasta que los cultivos mostraron un CPE completo. Los sobrenadantes de los cultivos celulares se recogieron y combinaron. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 1475 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, los sobrenadantes se almacenaron en tubos de congelación a -80 °C.

Para la purificación de cuerpos densos, se infectaron veinte matraces de cultivo de tejidos de 175 cm2 con 1,8 × 106 HFF con 1 ml de sobrenadante de virus congelado de la cepa HCMV TR-ΔGFP, diluido en 4 ml de medio MEM al 5%. Después de la adsorción del virus durante 1,5 h, se agregaron 15 ml de medio MEM fresco al 5%, suplementado con 50 nM de Letermovir (LMV) y se incubaron HFF durante al menos 7 días. Se añadió LMV al medio de cultivo celular cada 3 días después de la infección inicial. LMV es un inhibidor altamente específico del complejo HCMV terminasa y se demostró que inhibe la replicación de HCMV en cultivos celulares al interferir con la escisión/empaquetamiento de los genomas de HCMV en cápsidas nucleares19. Se recogieron los sobrenadantes de HFF infectado que mostraron un efecto citopatogénico completo (CPE) y se eliminaron los restos celulares macroscópicos mediante centrifugación durante 10 minutos a 1475 × g. Posteriormente, las partículas virales se sedimentaron mediante ultracentrifugación a 95.000 × g durante 70 minutos a 10 ° C utilizando un rotor 45Ti en una ultracentrífuga Beckman Optima L-90K. Para el fraccionamiento de las partículas, los gránulos se resuspendieron en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se cargaron en gradientes de densidad de tartrato de glicerol. Para la preparación del gradiente, se utilizaron 5 ml de una solución de tartrato de Na al 35% en tampón de fosfato de Na 0,04 M, pH 7,4 y 4 ml de una solución de tartrato de Na al 15% y glicerol al 30% en tampón de fosfato de Na 0,04 M, pH 7,4. se mezcló en un mezclador de gradiente y se introdujo en un tubo de centrífuga de policarbonato (14 ml; tubos de centrífuga Beckman Ultra-Clear) en un ángulo de 45°. Los gradientes se cubrieron con 1 ml de suspensión concentrada de partículas virales y se centrifugaron en un rotor oscilante Beckman SW41Ti durante 60 minutos a 90.000 x g y 10 ° C sin desaceleración. Posteriormente, la fracción DB se visualizó mediante dispersión de luz y se recogió punzando el tubo con una jeringa. La fracción recogida de los gradientes que contenían DB se lavó con 10 ml de PBS y los DB se concentraron mediante ultracentrifugación utilizando un rotor oscilante SW41Ti durante 90 min a 98.000 x g y 10 °C. Finalmente, el sedimento DB se resuspendió en 250 µl de PBS. Se prepararon alícuotas de 30 µl y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Para la determinación de las concentraciones de proteína DB, se utilizó el kit de ensayo de proteínas BCA Pierce™ (23225, ThermoFisher Scientific, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Los DB se descongelaron y se irradiaron con luz ultravioleta (UV) poco antes de aplicarlos a las células. Después de la resuspensión en un volumen total de 120 µl de PBS, las DB se transfirieron a una placa puntual y se irradiaron con UV a una longitud de onda de 254 nm durante 2 minutos. Luego, se mezclaron 100 µl de la solución de DB/PBS irradiada con UV con 2,9 ml de medio de cultivo y se añadieron a las células.

Se sembraron HFF a una densidad de 0,5 × 106 en dos placas de 10 cm. Al día siguiente, se irradiaron con UV 20 µg de DB derivado de TR-∆GFP y se agregaron a cada placa. El inóculo DB se incubó durante 2 h. Posteriormente, se agregaron 7 ml de medio MEM y las células se incubaron durante 22 h más. A continuación, se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con PBS. Se combinaron los HFF de dos placas y se determinó el número de células. Se lisaron 1 x 106 fibroblastos en 40 µl de tampón Laemmli 2x sin tinción con azul de bromofenol y se calentaron a 99 ° C durante 10 minutos. Después de enfriar, se agregaron el tampón de muestra NuPAGE LDS (4x) (Life technologies) y DTT 100 mM y las muestras se incubaron a 70 °C durante 10 minutos más.

Se sembraron células endoteliales a una densidad de 0,6 x 106 en dos placas de 10 cm en ausencia de doxiciclina. Las CE se expusieron a 40 µg de DB irradiado con UV de la cepa HCMV TR-∆GFP. Los siguientes pasos se realizaron como se describe para HFF.

Las proteínas se cargaron en un gel NuPAGE Bis-Tris al 10% y se resolvieron brevemente. A continuación, el gel se tiñó con azul de Coomassie y se cortó en cubos pequeños con un bisturí limpio. La tinción en gel se realizó en etanol al 50%/bicarbonato de amonio 25 mM. La reducción de proteínas se realizó en DTT 10 mM a 56 °C, seguida de alquilación en yodoacetamida 50 mM en la oscuridad a temperatura ambiente. Se usó tripsina (1 µg por muestra) para digerir las proteínas en tampón TEAB (bicarbonato de trietilamonio) 50 mM durante la noche a 37 °C. La extracción de péptidos se realizó secuencialmente en acetonitrilo al 30% y al 100%. Posteriormente, el volumen de la muestra se redujo en un evaporador centrífugo para eliminar el acetonitrilo residual. Luego, la muestra se llenó con TEAB 100 mM para alcanzar un volumen de muestra final de 100 µl.

De acuerdo con el esquema de diseño experimental20, las muestras digeridas se etiquetaron como "ligeras", "medianas" o "pesadas" agregando 4 µl de solución de formaldehído al 4%, formaldehído-d2 o formaldehído-13C, d2, respectivamente. A esto le siguió la adición de 4 µl de NaBH3CN 0,6 M (a la muestra “ligera” o “mediana”) o NaBD3CN (a la muestra “pesada”). Posteriormente, las muestras se incubaron a temperatura ambiente con agitación orbital durante 1 h. Luego se detuvo la reacción de marcado añadiendo 19 µl de bicarbonato de amonio 1 M (concentración final 150 mM) y se incubó a temperatura ambiente con agitación orbital durante 15 minutos. Posteriormente, los péptidos se acidificaron con ácido fórmico hasta alcanzar un pH ~3. Luego se combinaron las muestras marcadas pareadas. La solución peptídica resultante se purificó mediante extracción en fase sólida en C18 StageTips21).

Los péptidos se separaron en una columna analítica de 30 cm empaquetada internamente (diámetro interior: 75 μm; perlas ReproSil-Pur 120 C18-AQ de 1,9 μm, Dr. Maisch GmbH; calentada a 40 °C) mediante cromatografía en línea de fase inversa a través de un gradiente no lineal de 225 minutos de 1,6 a 32 % de acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico a una velocidad de nanoflujo de 225 nl/min. Los péptidos eluidos se pulverizaron directamente mediante ionización por electropulverización en un espectrómetro de masas Q Exactive Plus Orbitrap (Thermo Scientific). La adquisición dependiente de los datos se llevó a cabo utilizando un método top10. Después de cada escaneo completo (rango de masa: 300 a 1650 m/z; resolución: 70 000, valor objetivo: 3 × 106, tiempo máximo de inyección: 20 ms), se realizaron hasta 10 escaneos MS2 mediante disociación de colisión de mayor energía (energía de colisión normalizada). : 25%, resolución: 17.500, valor objetivo: 1 × 105, tiempo máximo de inyección: 120 ms, ventana de aislamiento: 1,8 m/z). La selección del estado de carga se realizó rechazando iones precursores de estado de carga no asignado o +1. El tiempo de exclusión dinámica se estableció en 35 s.

Los archivos de datos sin procesar fueron procesados por el paquete de software MaxQuant (versión 2.1.3.0)22 utilizando el motor de búsqueda Andrómeda23. Se buscaron datos espectrales en una base de datos de señuelo objetivo que consta de secuencias directas e inversas de proteomas UniProt descargados el 10 de agosto de 2022 enumerados para los ID de taxón específicos (ID 9606, H. sapiens, 79759 entradas; ID 10359, HCMV, 17993 entradas; ID 10363, cepa HCMV Town, 304 entradas) y una lista de 246 contaminantes comunes. Las etiquetas de dimetilo correspondientes se asignaron como "ligeras" (DimethLys0 y DimethNter0), "medianas" (DimethLys4 y DimethNter4) y "pesadas" (DimethLys8 y DimethNter8) de acuerdo con el esquema de etiquetado. Para cada péptido, se permitieron hasta 3 aminoácidos marcados. Se eligió tripsina/P por la especificidad de la enzima. Se seleccionó la carbamidometilación de cisteína como modificación fija. La acetilación del extremo N de la proteína y la oxidación de la metionina se asignaron en modificaciones variables. Se toleraron hasta 2 escisiones omitidas. Se requirió una longitud mínima de péptido de 7 aminoácidos. Para la identificación de péptidos y proteínas, se eligió una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1%.

Para la cuantificación de proteínas, el recuento de proporción mínima se estableció en uno. Para la cuantificación se utilizaron tanto los péptidos únicos como los de afeitar. Se activó la función “recuantificar”. También se optó por la opción “estimación avanzada de ratios”. Se filtraron los impactos inversos y los posibles contaminantes. Se retuvieron los grupos de proteínas con al menos un péptido único. Las proporciones de muestras con etiquetas intercambiadas se invirtieron para representar el tratamiento de cuerpos densos (DB) sobre el control para todas las réplicas técnicas y biológicas. Luego, las proporciones normalizadas se transformaron log2 y se centraron en la mediana. Posteriormente, se promediaron las proporciones de las réplicas técnicas pertenecientes a la misma réplica biológica ignorando el valor faltante si estaba presente.

Siguiendo los pasos mencionados anteriormente, se realizó un análisis estadístico para identificar proteínas reguladas diferencialmente utilizando el paquete de software limma en R24. Para los fibroblastos, se conservaron proteínas con proporciones en al menos tres de cinco réplicas biológicas. Para las células endoteliales, se conservaron proteínas con proporciones en al menos dos réplicas biológicas. Luego se ajustó un modelo lineal para evaluar las proporciones de cada proteína sin ajustes adicionales para pruebas múltiples. El cambio de log2 y la importancia de la diferencia se mostraron en un gráfico de volcán. Sólo las proteínas con un cambio mínimo de log2 de 1 y un valor de p inferior a 0,05 se consideraron reguladas diferencialmente.

En nuestro estudio de proteómica, investigamos el impacto de la incubación de cuerpos densos (DB) de HCMV en dos tipos de células diferentes. Los cambios en el proteoma celular de fibroblastos o células endoteliales tras la aplicación de DB se compararon con muestras de referencia tratadas de forma simulada.

Con cinco réplicas biológicas, se identificaron 3757 grupos de proteínas en total en fibroblastos después de múltiples pasos de filtrado riguroso y análisis de limma. Utilizando un límite doble, quedaron 153 proteínas, de las cuales 68 mostraron un valor de p inferior a 0,05. Se consideró que estas 68 proteínas se expresaban diferencialmente 24 h después de la aplicación de DB a los fibroblastos y se enumeran en la Tabla 1. Los resultados se muestran en un gráfico de volcán en la Fig. 1a. 33 proteínas estaban reguladas positivamente mientras que 35 estaban reguladas negativamente en las células tratadas con DB en comparación con las células tratadas de forma simulada. Para caracterizar las relaciones entre las 68 proteínas expresadas diferencialmente, se aplicó la herramienta en línea STRING (http://string-db.org/, consultada el 16 de mayo de 2023) para analizar los socios que interactúan. El análisis de la red de interacción proteína-proteína (PPI), representado en la Fig. 1b, muestra un grupo principal compuesto de proteínas que funcionan en procesos biológicos de respuesta al interferón tipo I, respuesta de defensa al virus, respuesta al virus y vías de señalización mediadas por citoquinas (Fig. .1b). El gráfico de barras de la Fig. 1c muestra los procesos biológicos enriquecidos ordenados según tasas crecientes de falsos descubrimientos (FDR). Sorprendentemente, cuando las 68 proteínas alteradas se enviaron a la herramienta en línea de la base de datos Interferome (v2.01, consultada en noviembre de 202225), la mayoría (66%) de ellas fueron identificadas como genes estimulados por interferón (ISG) (Fig. 1d). .

Análisis de proteomas de proteínas reguladas por DB en HFF. Los HFF se trataron de forma simulada o se incubaron con 20 µg de DB inactivado por UV derivado de TR-∆GFP. Los lisados celulares se sometieron a análisis MS/MS de proteoma total a las 24 h después de la aplicación de DB. ( a ) Gráfico del volcán que muestra el cambio de log2 (eje x) versus la importancia (eje y) de un total de 3757 proteínas, detectadas en cinco réplicas biológicas. Las líneas de puntos en naranja muestran el cambio de pliegue de corte de ±1,0 y un valor p de 0,05. La significancia (valor p no ajustado) y el cambio se convierten a −log10(valor p) y log2 cambio, respectivamente. Hubo 33 proteínas que aumentaron> 1,0 veces con un valor de p <0,05 (puntos verdes) y 35 proteínas que disminuyeron <-1,0 veces con un valor de p <0,05 (puntos rojos). La proteína del tegumento del HCMV pp65 (UL83) está resaltada en naranja y su detección se utilizó como control positivo, lo que indica la internalización de DB en HFF. El gráfico del volcán se generó utilizando el software R. ( b + c ) Análisis de interacción proteína-proteína (PPI) y clasificación funcional de las proteínas reguladas en HFF después de la estimulación con DB. (b) Visualización de la red STRING PPI generada al ingresar las 68 proteínas reguladas en la base de datos STRING. Los nodos de la red representan todas las proteínas producidas por un único locus genético codificante de proteínas. Los nodos están coloreados según su función en los procesos biológicos indicados en c. Los nodos grises indican proteínas conectadas a las proteínas de entrada pero sin asociación con los procesos biológicos. Las conexiones reflejan la interacción de proteínas y el grosor de la línea indica la solidez del soporte de los datos, utilizando un límite de confianza alto con una puntuación de 0,7. Se eliminaron las proteínas que no interactuaban con otras proteínas de la red. (c) Gráfico de barras de los procesos biológicos relacionados con las proteínas que se encontraron reguladas en HFF después de la estimulación con DB. El acuerdo se realizó de acuerdo con tasas crecientes de falsos descubrimientos (FDR). El eje y representa categorías de procesos biológicos, mientras que el eje x indica el número de genes involucrados en cada categoría. (d) Mapa de calor de los 45 ISG alterados. Los patrones de expresión se organizaron jerárquicamente en función de la media de la proporción normalizada convertida en log2 de 5 réplicas biológicas. El log2FC se representa con un degradado de color. IFN, interferón; ISG, gen estimulado por interferón; STRING, herramienta de búsqueda para la recuperación de genes que interactúan.

Se analizaron proteínas celulares reguladas tras la exposición de cuerpos densos a células endoteliales a partir de al menos dos réplicas biológicas. Según los criterios de filtrado utilizados anteriormente, se encontró que 83 proteínas alteradas (enumeradas en la Tabla 2) estaban reguladas diferencialmente y se muestran en el gráfico del volcán en la Fig. 2a. Para identificar los efectos del tratamiento con DB en las vías celulares, se utilizó la base de datos STRING (https://string-db.org, consultada el 20.10.2022). La red PPI en la Fig. 2b muestra las interacciones entre las 83 proteínas reguladas, utilizando la puntuación de interacción de alta confianza de 0,7. Cada una de las proteínas expresadas diferencialmente se asignó a tres o cuatro redes funcionales principales que estaban conectadas por las proteínas centrales CDK1 o TP53. Un grupo está compuesto por las proteínas MX1, ISG15, BST2 e IRF3, que se sabe que funcionan en la vía de señalización del interferón tipo I. Las otras dos redes fuertemente conectadas comprenden proteínas CDK y KIF, ambas asociadas con el ciclo celular. Las diez categorías principales de procesos biológicos que se enriquecieron con la aplicación de DB en células endoteliales se representan en el gráfico de barras de la Fig. 2c y están organizadas de acuerdo con tasas crecientes de falsos descubrimientos (FDR). Las 83 proteínas se enviaron a la base de datos Interferome (v2.01, consultada en noviembre de 2022)25. Se identificaron 60 proteínas como genes estimulados por interferón, la mayoría de las cuales estaban reguladas negativamente (Fig. 2d).

Análisis proteómico cuantitativo de proteínas reguladas diferencialmente en CE tratadas con DB. Las células endoteliales se incubaron con 40 µg de DB inactivado por UV (cepa TR-∆GFP) o se dejaron sin tratar. Los lisados celulares se prepararon 24 h después de la aplicación y se sometieron a análisis de proteoma. ( a ) Las 2719 proteínas identificadas por MS a partir de tres réplicas biológicas se muestran en un gráfico de volcán de acuerdo con su valor p estadístico (eje y) y su relación de abundancia relativa (cambio de log2 veces) entre las células tratadas con DB y simuladas ( eje x). Los puntos rojos indican proteínas expresadas diferencialmente que se redujeron significativamente después del tratamiento con DB (cambio en veces> 1,0; p <0,05). Los puntos azules indican proteínas expresadas diferencialmente que estaban significativamente reguladas al alza (cambio veces <1,0; p <0,05). La proteína del tegumento viral pp65 (UL83) está resaltada en naranja y se utilizó como control para la internalización de DB en las CE. El gráfico del volcán se generó utilizando el software R. ( b ) Red de interacción proteína-proteína STRING de las 83 proteínas que se expresaron diferencialmente en las CE tras el tratamiento con DB. Se eliminaron las proteínas que no tenían asociaciones con otras proteínas de la red. Los nodos de la red representan todas las proteínas producidas por un único locus genético codificante de proteínas. Las líneas representan la interacción de proteínas y el grosor de la línea indica la solidez del soporte de datos con un límite de confianza mínimo de 0,7 (confianza alta). (c) Gráfico de barras de los procesos biológicos enriquecidos asociados con proteínas expresadas diferencialmente. Los diez principales procesos biológicos enriquecidos están ordenados según tasas crecientes de falsos descubrimientos (FDR). El eje y representa categorías de procesos biológicos, mientras que el eje x indica el número de genes involucrados en cada categoría. (d) 60 proteínas reguladas diferencialmente fueron designadas como IRG. El log2FC se representa con un degradado de color. Los 20 ISG regulados al alza se indican en azul y los 40 ISG regulados a la baja se indican en rojo. STRING, herramienta de búsqueda para la recuperación de genes que interactúan.

La validación de los análisis de EM proporcionados aquí se publicó en otro lugar11. En ese estudio, evaluamos la expresión de las proteínas seleccionadas MX1, IFIT3 e ISG15 en fibroblastos y células endoteliales mediante análisis de transferencia Western. Los resultados de la transferencia Western fueron consistentes con los resultados obtenidos a partir de los datos de MS. Se pudo confirmar un fuerte aumento en los niveles de expresión de las tres proteínas tras el tratamiento con DB. Aunque los cambios en veces no fueron idénticos en los análisis de inmunotransferencia, en comparación con los datos de MS a 24 hpa, las tendencias fueron similares. En conjunto, estos resultados experimentales muestran que nuestros datos proteómicos son confiables.

Todos los datos sin procesar de espectrometría de masas, archivos fasta y archivos de texto de salida directa del análisis MaxQuant están disponibles en el repositorio asociado de Proteomics Identifications (PRIDE)20 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039032)26.

Para permitir la coherencia entre las diferentes preparaciones de DB, se infectaron HFF del mismo pasaje con el mismo lote de sobrenadante stock HCMV TR-∆GFP.

Después de cada preparación, se analizó la capacidad de los cuerpos densos purificados para ingresar a las células. Para ello, se tomó una tinción nuclear de la proteína pp65 del tegumento principal viral como prueba de entrada en las células26,27. Se cultivaron 2 × 105 HFF o EC en cubreobjetos y se incubaron con 5 µg (HFF) o 10 µg (EC) de DB de TR-∆GFP y se analizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia un día después de la aplicación. Las células se fijaron con acetona al 90%. La localización nuclear de pp65 derivada de DB se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal específico de pp65 y un anticuerpo secundario conjugado anti-ratón Alexa Fluor® 546. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (Sigma-Aldrich). La visualización se realizó mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Axiophot equipado con una cámara SPOT Flex FX1520 (Zeiss, Jena, Alemania).

Para tener en cuenta la posible variación técnica y biológica, el estudio se realizó utilizando réplicas técnicas y múltiples réplicas biológicas (5 para fibroblastos; 2 para células endoteliales). La regulación de la abundancia de proteínas inducida por el tratamiento con HCMV DB fue generalmente consistente en todas las réplicas biológicas en ambos tipos de células, especialmente con respecto a la inducción de la represión de proteínas individuales (Figs. 3, 4 y 5). Como se describe en la sección de métodos, realizamos varios pasos de filtrado riguroso de los datos. Para identificar proteínas que estaban reguladas consistentemente en réplicas biológicas, utilizamos el modelado lineal para cuantificar la importancia de la regulación. Debido al efecto del lote, observamos menos eventos de cuantificación e intensidades más bajas para las réplicas 4 y 5, en comparación con las tres primeras réplicas. A pesar de eso, el enfoque de marcaje de isótopos mediante marcaje con dimetilo hizo que la comparación entre las condiciones fuera sólida dentro de cada réplica (Fig. 3). Sin embargo, aumentamos aún más el requisito de filtrado estricto de la detección en dos de cinco réplicas a al menos tres en el conjunto de datos de fibroblastos.

Reproducibilidad de las proporciones log2 de proteína detectada entre los tratados con DB y el control en cinco réplicas de fibroblastos. La diagonal indica una alineación perfecta. La proteína viral UL83 está regulada positivamente como se esperaba. Tenga en cuenta que se detectaron dos isoformas diferentes de la proteína UL83 en la réplica 3.

Se detectaron intensidades de proteínas de los tratados con DB frente al control en las cinco réplicas de fibroblastos. Cada cuadro representa la mediana y el rango intercuartil.

Reproducibilidad de las proporciones log2 de proteína detectada entre los tratados con DB y el control en tres réplicas de células endoteliales. La diagonal indica una alineación perfecta. Se confirma que la proteína viral UL83 está regulada positivamente como se esperaba.

Los procedimientos de análisis de datos se han descrito en detalle en la sección Métodos. El código para el análisis estadístico realizado en R está disponible como archivo complementario.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Wilhelm-Sander, números de subvención 2016.115.1 y 2020.003.1.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Virología, Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg, Mainz, Alemania

Inessa Penner y Bodo Plachter

Instituto de Biología Molecular, Universidad Johannes Gutenberg, Mainz, Alemania

Mario Dejung, Anja Freiwald, Falk Butter y Jia-Xuan Chen

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Conceptualización, IP y BP; Curación de datos, IP, MD y JXC; Análisis formal, IP, FB y BP; Adquisición de financiación, BP; Investigación, IP y BP; Metodología, IP, MD y JXC; Supervisión, BP; Validación, IP, MD, AF, JXC; FB y BP; Redacción: borrador original, IP y BP; Redacción, revisión y edición, JXC Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Bodo Plachter.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Penner, I., Dejung, M., Freiwald, A. et al. Cambios proteómicos de fibroblastos y células endoteliales tras la incubación con cuerpos densos subvirales del citomegalovirus humano. Datos de ciencia 10, 517 (2023). https://doi.org/10.1038/s41597-023-02418-2

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Recibido: 19 de enero de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-023-02418-2

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