Codificación de luminiscencia de microperlas poliméricas con tintes orgánicos y puntos cuánticos semiconductores durante la polimerización.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 12061 (2022) Citar este artículo

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Las microperlas codificadas por luminiscencia son herramientas importantes para muchas aplicaciones en las ciencias de la vida y los materiales que utilizan detección de luminiscencia, así como estrategias de multiplexación y códigos de barras. La preparación de tales perlas a menudo implica la tinción de perlas prefabricadas con luminóforos moleculares utilizando procedimientos de hinchamiento simples o funcionalización de superficies con técnicas capa por capa (LbL). Alternativamente, estos luminóforos se incorporan estéricamente durante la reacción de polimerización produciendo las perlas de polímero. Las propiedades ópticas favorables de los puntos cuánticos semiconductores (QD), que presentan bandas de emisión estrechas, de tamaño ajustable y ampliamente excitables y una baja sensibilidad al fotoblanqueo, desencadenaron la preparación de perlas teñidas con QD. Sin embargo, la naturaleza coloidal y la química de la superficie de estos QD, que controla en gran medida sus propiedades de luminiscencia, introducen nuevos desafíos para la codificación de perlas que apenas se han evaluado sistemáticamente. Para establecer un enfoque sencillo para la codificación de cuentas con QD con pérdida minimizada de luminiscencia, evaluamos sistemáticamente la incorporación de CdSe/CdS-core/shell-QD estabilizados con ácido oleico/oleilamina en microesferas de poliestireno (PS) de 0,5 a 2,5 µm de tamaño. mediante una simple síntesis de polimerización en dispersión que se optimizó primero con el tinte orgánico Nile Red. Los parámetros abordados para la preparación de perlas codificadas por luminóforos incluyen el uso de un ligando compatible con polímeros, como el cloruro de bencildimetiloctadecilamonio (OBDAC) para los QD, y la reticulación para evitar fugas de luminóforos. Las propiedades fisicoquímicas y ópticas de las perlas resultantes se investigaron con microscopía electrónica, dispersión dinámica de luz, espectroscopia óptica y microscopía de fluorescencia. La distribución del tamaño de las partículas, el rendimiento cuántico de fluorescencia de los QD encapsulados y la estabilidad de las fugas de QD se utilizaron como medidas para la calidad de las perlas. El procedimiento de codificación de perlas optimizado derivado permite la preparación reproducible de microperlas de PS brillantes codificadas con tintes orgánicos, así como con CdSe/CdS-QD. Aunque estas perlas muestran un rendimiento cuántico de fotoluminiscencia reducido en comparación con las QD inicialmente muy fuertemente luminiscentes, con valores de alrededor del 35%, su rendimiento cuántico de fotoluminiscencia sigue siendo moderado.

Las perlas de polímero luminiscente, codificadas con luminóforos moleculares o a nanoescala, se han empleado cada vez más en las ciencias de la vida y los materiales en las últimas décadas junto con la espectroscopia de fluorescencia, la microfluorometría, la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo. Estas partículas suelen estar equipadas con grupos funcionales de superficie a los que se pueden unir restos de reconocimiento como proteínas y anticuerpos o colorantes que responden a analitos1,2. Esto abre muchas aplicaciones diferentes, incluidas (bio)imagen, ensayos biomédicos y detección química3,4,5,6,7,8. Si bien las nanoperlas de polímeros luminiscentes se emplean a menudo para el etiquetado celular y plataformas de ensayo, normalmente se utilizan microperlas más grandes para bioensayos basados ​​en perlas y esquemas de multiplexación espectral8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. ,20,21, utilizando codificación de color o recientemente también codificación de por vida22, junto con citometría de flujo o microscopía de fluorescencia. Aquí, el color de luminiscencia o la vida útil de las perlas portadoras codificadas se utiliza como código de identificación para la química de la superficie de la perla y el objetivo capturado posteriormente unido a la perla se cuantifica con la ayuda de una etiqueta fluorescente espectralmente distinguible adicional. Las perlas codificadas de tamaño nanométrico y micrométrico también se pueden utilizar para aplicaciones de seguridad, antifalsificación y autenticación y códigos impresos23,24,25.

Un enfoque común para la codificación de luminiscencia de perlas de polímero presenta el hinchamiento de perlas prefabricadas de poliestireno (PS) o polimetilmetacrilato (PMMA) mediante la adición de un disolvente orgánico apolar que contiene luminóforos, que permite que los luminóforos impregnen la matriz de perlas26,27,28. Dichos procedimientos se han utilizado, por ejemplo, para la fabricación de perlas con diferentes funcionalidades superficiales, que se aplican como soportes para plataformas basadas en perlas5. Alternativamente, se puede realizar un recubrimiento capa por capa de perlas prefabricadas. Este enfoque versátil implica la deposición paso a paso de capas de polielectrolitos con carga opuesta que contienen nanocristales como puntos cuánticos semiconductores coloidales (QD) o tintes orgánicos29,30,31,32. De este modo, solo se logra la tinción de la superficie y la química de la superficie de la perla alterada en consecuencia puede imponer desafíos en los pasos de bioconjugación posteriores. Otro método es la incorporación del luminóforo durante la reacción de polimerización, tanto para colorantes orgánicos33,34,35,36 como para diferentes nanocristales13,37,38,39,40,41,42,43. En este caso, el compuesto luminiscente se disuelve o dispersa en la solución de monómero o se añade a la mezcla de reacción. Este procedimiento puede proporcionar una distribución homogénea del luminóforo dentro de las perlas, pero requiere emisores suficientemente estables con una solubilidad o dispersabilidad adecuada que pueda sobrevivir a las condiciones de polimerización ocasionalmente duras44.

Si bien los procedimientos para la incorporación de moléculas de tinte orgánico en perlas poliméricas de diferente composición química, tamaño y química de superficie están relativamente bien establecidos, la codificación de perlas con luminóforos a nanoescala como los QD con sus muy amplios espectros de absorción, estrechas bandas de emisión y alta fotoestabilidad está lejos de ser posible. más complejo3,17,45. Estos nanocristales luminiscentes con tamaños <10 nm comúnmente tienen una arquitectura de partículas de núcleo/cubierta que consiste en un núcleo inorgánico, una cubierta de pasivación de superficie inorgánica y una cubierta de ligando orgánico estabilizador, que garantiza la dispersabilidad y la estabilidad coloidal46. Como la química de la superficie de los QD no sólo es muy importante para su estabilidad coloidal sino que también controla en gran medida sus propiedades de fotoluminiscencia (PL), particularmente su rendimiento cuántico de fotoluminiscencia, esto introduce desafíos considerables para la codificación de perlas de polímero sin riesgo de agregación de QD y una significativa Pérdida en luminiscencia QD4,38,41,47,48,49. Esto está relacionado con el hecho de que el proceso de incorporación de perlas puede modificar el número de ligandos en la superficie QD, introduciendo así estados de trampa adicionales mediante la eliminación del ligando, o requerir un intercambio de ligando primero para garantizar la compatibilidad de la química de la superficie QD con el monómero/ fase polimérica, que también puede resultar en la extinción de la luminiscencia47.

La codificación reproducible con nanocristales como los QD requiere una consideración cuidadosa de todos los parámetros que controlan su estabilidad y funcionalidad coloidal y, por lo tanto, comúnmente una adaptación de los procedimientos de codificación establecidos para los luminóforos moleculares. La utilización de un procedimiento de hinchamiento, que se ha informado para diferentes tipos de perlas poliméricas17,20,47,50, requiere un control cuidadoso de la distribución del tamaño de los poros dentro de las perlas y puede provocar una tinción no homogénea de las perlas, una baja densidad de carga QD, falta de reproducibilidad y posterior fuga QD47. Además, el procedimiento de hinchamiento y los disolventes pueden afectar considerablemente las propiedades de luminiscencia de los QD y provocar una extinción de la luminiscencia. El recubrimiento capa por capa de partículas prefabricadas de diferente composición química para QD requiere mucho tiempo, puede llevar a una ampliación de la distribución inicial del tamaño de las perlas y requiere diferentes pasos de purificación que resultan en una pérdida de material51,52,53,54,55. Además, la influencia de este procedimiento de codificación sobre las propiedades PL de los QD incorporados aún no se ha evaluado sistemáticamente. El procedimiento utilizado con más frecuencia para la fabricación de perlas codificadas con QD presenta la incorporación de las QD durante la reacción de polimerización, por ejemplo, para la preparación de micropartículas de PS o perlas de PS que contienen divinilbenceno (DVB) o PMMA4,13,37,38. 39,40,41,42,43,48,56,57,58,59,60 y poliisopreno así como perlas de poli(ácido láctico-co-glicólico)2,3,45,61. Las técnicas de polimerización empleadas incluyen polimerización en (mini)emulsión y suspensión4,13,37,38,39,40,41,42,43,47,56,58,59 así como enfoques microfluídicos más complicados9,10,14,16,62 . Casi todos estos procedimientos utilizan QD basados ​​en Cd, como CdSe, CdSe/ZnS o CdTe, que comúnmente se estabilizan con una combinación de ligandos de trioctilfosfina (TOP)/óxido de trioctilfosfina (TOPO). Ocasionalmente, se introdujo un ligando polimerizable en la superficie de QD para una mejor compatibilidad de los QD con la mezcla de reacción y una mejor incorporación de perlas48,57.

A pesar de muchos informes sobre perlas de polímero codificadas con QD, hasta ahora, la influencia de la incorporación de perlas en las propiedades PL de los QD no se ha estudiado sistemáticamente y, por lo general, las características PL de los QD iniciales no se comparan, o sólo se comparan de manera muy aproximada, con las de los QD iniciales. perlas teñidas con QD resultantes. En particular, los cambios en el rendimiento cuántico de la fotoluminiscencia (PL) (PLQY) no se han examinado a fondo, aunque esta propiedad, que equivale al número de fotones emitidos por número de fotones absorbidos, determina en gran medida la intensidad de la señal de PL y el brillo de las perlas. Además, PLQY proporciona una medida directa de la calidad y estanqueidad de las cubiertas de pasivación de la superficie QD y permite conocer los cambios en la cubierta del ligando49,63,64. Esto nos animó a desarrollar un procedimiento simple para sintetizar microperlas de PS luminiscentes con tamaños de aproximadamente 1 μm codificadas con tintes orgánicos hidrofóbicos y QD de núcleo/cubierta estabilizados con ligando a través de una polimerización en dispersión de estireno con pérdida minimizada en la luminiscencia inicial. Por lo tanto, de manera representativa para el Rojo Nilo (NR) y los QD de CdSe/CdS-núcleo/cubierta estabilizados con ácido oleico (OA)/oleilamina (OLA), se examinaron sistemáticamente diferentes condiciones de polimerización, como temperatura, velocidad de agitación, cantidad de iniciador, reacción. tiempo, y la adición del reticulante divinilbenceno (DVB), así como la química de superficie QD y el uso de un ligando de superficie QD compatible con polímeros. La caracterización de las microperlas codificadas comprendió la determinación del tamaño de las partículas y la distribución del tamaño con dispersión dinámica de la luz (DLS) y microscopía electrónica, así como el mapeo elemental de las perlas codificadas con QD mediante espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDXS) para QD. localización dentro de las cuentas. Además, las propiedades de fluorescencia de los luminóforos antes de la reacción de polimerización y en las perlas se determinaron mediante PL y espectroscopía de esfera integradora, así como microscopía de barrido láser confocal (CLSM) en el caso de las perlas teñidas con luminóforos. De este modo, pudimos identificar parámetros que proporcionan microperlas de PS fuertemente luminiscentes con una distribución de tamaño estrecha y una pérdida minimizada, aunque aún notable, en PLQY de los QD incorporados en las perlas.

Estireno (≥ 99,0%), divinilbenceno (DVB, 80%), azobisisobutironitrilo (AIBN, 98%), 2-etilhexanoato de estaño (II) (92,5–100%), ε-caprolactona (97%), poli(etilenglicol) (PEG, MW 2.500), óxido de trioctilfosfina (TOPO, 99%), 1-octadeceno (ODE, 90%), tolueno (≥ 99,7%), metanol (≥ 99,8%), isopropanol (≥ 99,8%), oleilamina (OLA , 70–80%), 1-octanotiol (98,5%) y acetona (≥ 99,5%) se obtuvieron de Sigma Aldrich Co. Polivinilpirrolidona (PVP, MW 40.000), óxido de cadmio (CdO, 99,998%), selenio en polvo (malla 200). , 99,999%) y el ácido oleico (OA, 90%) se adquirieron de Alfa Aesar. Tolueno, etanol y n-heptano (todos de calidad espectral), así como n-hexano (≥ 99%) se obtuvieron de Merck KGaA. El etanol (abs., 99,9 %) y el diclorometano (calidad HPLC) se obtuvieron de Chemsolute. El cloruro de bencildimetiloctadecilamonio (OBDAC, 98,9 %) se adquirió de HPC Standards GmbH, el rojo Nilo (NR) de Fluka Analytical, el ácido n-octadecilfosfónico (ODPA, > 99 %) de PCI Synthesis y tri-n-octilfosfina (TOP, 99,7 %) así como cloroformo deuterado (99,8 átomos%) de ABCR. Todos los disolventes utilizados para las mediciones ópticas eran de calidad espectroscópica y todos los productos químicos se emplearon tal como se recibieron sin purificación adicional.

Los QD de CdSe/CdS-core/shell-estabilizados con ácido oleico (OA)/oleilamina (OLA) se sintetizaron de acuerdo con una síntesis modificada descrita por Carbone et al., Nightingale et al. y Chen et al.65,66,67 que se describe en detalle en la Información complementaria (SI).

El copolímero de bloque polietilenglicol-poli(ε-caprolactona) (PEG-b-PCL) se sintetizó según un procedimiento adaptado por Meier et al.68 y se describe en detalle en el SI.

Para el recubrimiento de los QD estabilizados con OA/OLA, se añadió una punta de espátula de OBDAC a 100 µl de la solución de QD en tolueno en un vial. Luego se añadió etanol hasta alcanzar un volumen de 1 mL y la mezcla se colocó en un agitador a 200 rpm durante 5 min. Luego, los QD precipitados se centrifugaron con una microcentrífuga Eppendorf 5415 D a 8000 rpm durante 5 minutos y se lavaron una vez con etanol. Los QD recubiertos con OBDAC se redispersaron en 1 ml de estireno, se sellaron y se almacenaron en el refrigerador hasta su uso posterior.

La síntesis de las microperlas de PS codificadas se realizó según un procedimiento modificado descrito por Acter et al.69 y la reticulación de las perlas se implementó siguiendo un procedimiento de Li et al.70. Primero, se disolvieron 36,6 mg de PEG-b-PCL en 403 µl de tolueno. La mezcla se colocó en un agitador a 200 rpm durante 30 minutos para disolver el copolímero. Mientras tanto, se disolvieron secuencialmente 1,465 g de PVP y 36,6 mg de AIBN en 40 ml de etanol.

Para el colorante que codifica las perlas de polímero, se disolvieron 4 mg de Nile Red en 4 ml de estireno y 200 µl de DVB y luego la mezcla se sonicó brevemente. La mezcla etanólica, la mezcla de tinte-monómero y PEG-b-PCL disueltos en tolueno se añadieron a un matraz de fondo redondo de dos bocas de 100 ml en este orden. Normalmente, el matraz se selló bajo argón y se calentó a 70 °C en un baño de aceite. La reacción se agitó a 70 rpm durante 24 h antes de enfriar a temperatura ambiente. En caso de que se haya variado algún parámetro para la síntesis de perlas, esto se indica explícitamente en la siguiente sección. La dispersión de partículas resultante se centrifugó a 2000 rcf durante 10 min, se descartó el sobrenadante y las partículas restantes se lavaron una vez con etanol a 1600 rcf durante 10 min. Para estos pasos de lavado, se utilizó una Multifuge X1R de Thermo Fisher Scientific Inc. Luego, las microperlas de polímero se redispersaron en etanol y se almacenaron a temperatura ambiente en la oscuridad. Para la caracterización analítica, la solución madre de partículas se lavó adicionalmente tres veces con etanol y cada vez se centrifugó durante 10 minutos a 700 rcf para separar perlas más pequeñas y eliminar cualquier residuo de síntesis restante, como estireno o AIBN. Estos pasos de lavado se realizaron con una microcentrífuga Eppendorf 5415 D.

Para la codificación QD de las perlas de polímero, se añadió 1 ml de una dispersión de CdSe/CdS-QD estabilizados con ácido oleico/oleilamina en estireno, preparada como se describe en la sección anterior, a 3 ml de estireno. Para la reticulación de las perlas, se agregaron 50–200 µl de DVB y la mezcla se sonicó brevemente. La mezcla etanólica así como la solución de PEG-b-PCL en tolueno se prepararon como se describe anteriormente y se agregaron al matraz junto con la mezcla de monómero QD. Por lo demás, el procedimiento de reacción se realizó en las mismas condiciones que las empleadas para la preparación de las micropartículas codificadas con colorante.

Se registró a temperatura ambiente un espectro de 1H-NMR en solución del PEG-b-PCL sintetizado con un espectrómetro JEOL JNM-ECX400 de 400 MHz en la Universidad Libre de Berlín. La muestra de PEG-b-PCL se preparó disolviendo 6 mg de PEG-b-PCL en 700 µl de CDCl3. El espectro correspondiente, que confirma la identidad química del copolímero, se muestra en el SI (Fig. S1).

RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): δ = 1,38 (m, 2H, γ), 1,63 (m, 4H, β y δ), 2,30 (m, 2H, α), 3,64 (s, 4H, a y b ), 4,05 (t, 2H, ε), 4,21 (t, 2H, b).

El peso molecular medio numérico Mn del PEG-b-PCL sintetizado se calculó a partir de la relación de protones de las señales de PEG y PCL según Meier et al.68 y fue de aproximadamente 4840 g/mol.

Las mediciones de potencial DLS y zeta de las diferentes micropartículas se llevaron a cabo con un Zetasizer Nano ZS de Malvern Panalytical Ltd. a T = 25 °C en células capilares plegadas desechables (DTS1070), también de Malvern Panalytical Ltd. Todas las partículas se dispersaron en Milli- Q agua (Millipore) para estas mediciones.

Las mediciones de HAADF-STEM se realizaron utilizando un JEOL JEM-2100F-UHR de 200 kV operado a 200 kV y equipado con una pistola de emisión de campo, así como un Oxford Instruments INCA 200 para espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDXS) que permite el mapeo elemental. Las muestras se prepararon sobre rejillas de cobre recubiertas de carbono (Quantifoil) mediante fundición por goteo de la dispersión de microperlas etanólicas.

Las micrografías electrónicas de barrido se capturaron con un JEOL JSM-6700F. Las muestras tomadas de las dispersiones de microperlas etanólicas se colaron sobre soportes de latón. Las mediciones se realizaron utilizando voltaje y corriente de aceleración baja (1 kV y 2 µA).

Las mediciones de AAS se llevaron a cabo con un instrumento AA140 de Varian Inc. con un atomizador de llama de oxígeno/acetileno para determinar la concentración de Cd(II) en la dispersión QD. Se prepararon muestras de las dispersiones QD mediante disolución de las partículas con agua regia. Se utilizaron seis soluciones estándar con diferentes concentraciones de Cd(II) para obtener una curva de calibración para la cuantificación de la concentración de Cd(II).

Los espectros de absorción de CdSe / CdS-QD y Nilo Red en tolueno / estireno y las respectivas microperlas codificadas en etanol se registraron con un espectrofotómetro Specord 210plus de Analytik Jena a temperatura ambiente en cubetas de vidrio de cuarzo (10 × 10 ) mm de Hellma GmbH. Los diferentes QD y perlas codificadas con tinte para los experimentos de fugas se dispersaron en agua MilliQ y se midieron utilizando las mismas condiciones y configuraciones del instrumento.

Los espectros de emisión de CdSe/CdS-QD y Nilo Red en tolueno/estireno y las respectivas microperlas codificadas en etanol se registraron con un espectrómetro de fluorescencia FSP920 de Edinburgh Instruments Ltd. a temperatura ambiente en cubetas de vidrio de cuarzo (10 × 10) mm de Hellma GmbH. . La longitud de onda de excitación se fijó en 350 nm.

Los rendimientos cuánticos de fotoluminiscencia (PLQY) de las soluciones de los luminóforos en estireno/tolueno y las micropartículas codificadas por luminóforos en etanol se determinaron absolutamente con una configuración de esfera integradora Quantaurus independiente de Hamamatsu Photonics KK. Las mediciones se realizaron a 25 °C en ( Cubetas de vidrio de cuarzo de cuello largo de 10 × 10) mm de Hamamatsu Photonics K. K con una longitud de onda de excitación de 350 nm. Para las mediciones PLQY de soluciones de luminóforos transparentes, se utilizó el disolvente respectivo como blanco. Para todas las dispersiones de microperlas codificadas, se emplearon como blanco dispersiones de micropartículas simples sin teñir de tamaño y concentración de perlas similares.

Las mediciones de CLSM se realizaron utilizando el microscopio de barrido láser confocal Olympus FV1000 (Olympus, Alemania) basado en el microscopio invertido motorizado Olympus IX81 (Olympus, Alemania) y un objetivo de inmersión en agua de 60 × (AN = 1,2). Las imágenes de transmisión se midieron a 488 nm. Para el registro de las imágenes de fluorescencia, para una intensidad de señal óptima, se empleó excitación con un láser de 458 nm (87 % de potencia del láser) y un láser de 355 nm (99 % de potencia del láser) y la emisión de fluorescencia se registró en el rango de 560–660 Nuevo Méjico. Para estos experimentos, las soluciones madre de microperlas se lavaron tres veces con agua MilliQ, se redispersaron en agua MilliQ y se diluyeron a una concentración de 0,2 mg/ml. Se aplicó 1 µl de la muestra sobre un portaobjetos de vidrio de 0,17 mm.

La fotoestabilidad a corto plazo de las perlas codificadas en NR y QD se examinó con el microscopio de barrido láser confocal Olympus FV1000 de Olympus, Alemania, basado en el microscopio invertido motorizado Olympus IX81 de Olympus, Alemania, y un objetivo de inmersión en agua de 60 × (AN = 1,2). Se registraron imágenes de fluorescencia con una región de interés (ROI) dedicada con un láser de 458 nm para las perlas codificadas con QD (rango de emisión de 580 a 680 nm) y un láser de 514 nm para las perlas codificadas con NR (rango de emisión de 560 a 660 nm). ). El tamaño de la imagen se configuró en 512*512 px y se empleó una velocidad de escaneo de 8 µs/px, lo que resultó en un tiempo de adquisición de la imagen de 2,1 s. Se determinó que la potencia de excitación era de 1 mW en la trayectoria del haz para las dos fuentes de luz de excitación. Para la preparación de la muestra, las soluciones madre de microperlas se lavaron tres veces con agua MilliQ, se redispersaron en agua MilliQ y se diluyeron a una concentración de 0,2 mg/ml. Se aplicó 1 µl de la muestra sobre un portaobjetos de vidrio de 0,17 mm y se dejó secar antes de las mediciones.

La estabilidad a largo plazo del tinte NR, los QD y las perlas codificadas con NR y QD frente a la luz solar se probó con una configuración SUNTEST CPS + de Atlas Material Testing Technology GmbH. Las muestras secas se iluminaron durante siete días con una densidad de potencia de 650 W/m2 y una temperatura máxima de la cámara de 60 °C. La intensidad de PL de las muestras sólidas secas de NR, QD y las perlas de polímero codificadas por NR y QD se midió en intervalos de 24 h utilizando un espectrofluorómetro Dual-FL equipado con una esfera integradora Quanta-Phi, ambos de Horiba Scientific.

La versatilidad de las polimerizaciones en dispersión, que se pueden realizar en disolventes como agua o etanol, en combinación con su buena reproducibilidad y altos rendimientos, hacen que este enfoque sea muy atractivo para la síntesis de nanopartículas y micropartículas de polímeros codificadas por luminóforos. Con este enfoque clásico se pueden sintetizar nanopartículas poliméricas con tamaños de aproximadamente 50 a 200 nm y una distribución de tamaño estrecha utilizando un monómero, un tensioactivo y un iniciador radical3,4,35,39,40,43,45,48,56. 57,58,59,61. Para la codificación de perlas con tintes orgánicos hidrófobos, que son suficientemente estables para sobrevivir a las condiciones de polimerización, el luminóforo normalmente se disuelve directamente en el monómero líquido. La síntesis de micropartículas con tamaños desde unos 500 nm hasta varios cientos de µm requiere algunas modificaciones de este procedimiento, especialmente para la incorporación de pequeños nanocristales como QDs2,8,10,11,12,13,14,37,38,40 ,41,42,43,47,48,62. En el siguiente trabajo, la optimización de este procedimiento se realiza de manera ejemplar para el colorante solvatocrómico, hidrófobo y suficientemente estable Rojo Nilo (NR), que hemos utilizado anteriormente para evaluar y optimizar la carga de nanopartículas y micropartículas de PS prefabricadas con un procedimiento de hinchazón26,27. Esto se hizo para establecer la síntesis de perlas para el caso más simple, un fluoróforo molecular pequeño, y mostrar su idoneidad general para la preparación de perlas teñidas de manera homogénea. Posteriormente, determinamos las condiciones óptimas para la preparación de micropartículas de PS codificadas con QD brillantes y estables. Para ello sólo se varía un parámetro a la vez. De este modo, se puede evaluar consecutivamente la influencia del copolímero PEG-b-PCL, el recubrimiento QD con OBDAC y la reticulación con DVB. El procedimiento de reacción optimizado derivado para la codificación QD y tinte de microperlas de PS con tamaños de 0,5 a 2,5 μm se muestra esquemáticamente en la Fig. 1.

Presentación esquemática de las rutas de síntesis empleadas para la preparación de microperlas luminiscentes de poliestireno (PS), codificadas con (a) Nilo Red, (b) CdSe/CdS-QD estabilizadas con OA/OLA sin pretratamiento, y (c) OA/OLA -CdSe/CdS-QD estabilizados, sintetizados con el procedimiento desarrollado y optimizado, incluido el pretratamiento de los QD con el ligando compatible con polímeros OBDAC. Las fotografías de las respectivas dispersiones de perlas etanólicas se tomaron bajo luz diurna y ultravioleta.

Las microperlas de PS preparadas mediante polimerización en dispersión tienden a mostrar una amplia distribución de tamaños. Esto se debe principalmente a la nucleación secundaria que se produce durante los largos tiempos de crecimiento, lo que conduce a partículas de polímero de diferentes tamaños. Para abordar este desafío, agregamos el copolímero de bloques PEG-b-PCL a la mezcla de reacción como lo describen Acter et al.69. La adición de este copolímero anfifílico previene la nucleación y agregación secundaria durante la síntesis de perlas al estabilizar estéricamente las partículas en crecimiento. El efecto de PEG-b-PCL en la distribución de tamaño de las microperlas de PS resultantes se visualiza en la Fig. 2. Las imágenes SEM y los histogramas derivados de la distribución de tamaño muestran una distribución de tamaño significativamente más estrecha y regular con una desviación estándar más pequeña en la presencia de PEG-b-PCL. Aunque las partículas sin PEG-b-PCL son generalmente más grandes debido a la mayor cantidad de AIBN, esta influencia sigue siendo claramente visible. Esto confirma la influencia beneficiosa del PEG-b-PCL sobre las características de las partículas. Debido a estos hallazgos, se empleó PEG-b-PCL en todas las síntesis siguientes para tintes y perlas codificadas con QD para garantizar una distribución de tamaño estrecha de las perlas formadas.

Imágenes SEM y distribuciones de tamaño de partículas de las diferentes microperlas de PS preparadas: (a) sin adición de PEG-b-PCL (tolueno añadido sin PEG-b-PCL; síntesis con 500 mg de AIBN, sin reticulante) y (b) con adición de 36,6 mg de PEG-b-PCL en tolueno (síntesis con 100 mg de AIBN, reticulado con 200 µL de DVB). Condiciones utilizadas para la preparación de ambos tipos de perlas: 75 °C, velocidad de agitación de 70 rpm, tiempo de reacción de 24 h.

Las propiedades ópticas de NR se determinaron en estireno antes de la síntesis de partículas. Los espectros de absorción y emisión correspondientes se muestran en la Fig. 3. Se determinó que el PLQY de NR en estireno era del 86%.

Propiedades de luminiscencia de microperlas de PS codificadas por NR y NR. ( a ) Espectros de emisión y absorbancia normalizados (λexc = 350 nm) de NR en estireno; (b) PLQY de NR en estireno y en las microperlas resultantes en etanol en diferentes etapas; espectros de emisión (λexc = 350 nm) de microperlas de PS codificadas con NR en etanol preparadas (c) sin y (d) con la adición de 200 µl del reticulante DVB. Los espectros de emisión se normalizaron con respecto a los espectros de emisión negros del tinte NR registrados en la mezcla de reacción inicial antes de la polimerización para visualizar los cambios en la fluorescencia inducidos por la polimerización. Para la preparación de las microperlas codificadas por colorante, se utilizaron las siguientes condiciones: 65 °C, 100 mg de AIBN, 36,6 mg de PEG-b-PCL, velocidad de agitación de 100 rpm y tiempo de reacción de 24 h.

Para evaluar la influencia de la reticulación en las propiedades PL de las perlas, se sintetizaron microperlas codificadas por NR sin y con el reticulante DVB utilizando la misma cantidad de colorante (1 mg/ml de monómero). Según se deriva de las imágenes SEM, con un tamaño de 1262 ± 120 nm, las perlas reticuladas son más grandes que las no reticuladas y revelan un tamaño de 945 ± 166 nm. La desviación estándar del tamaño de partícula de ambas perlas es similar, aunque ligeramente mayor que para las partículas simples sin codificación de luminóforo previamente introducidas y analizadas.

Los espectros de emisión de la sonda de polaridad NR en la mezcla de reacción inicial antes de la polimerización, después de 24 h y después de cinco pasos de lavado se muestran en la Fig. 3. El desplazamiento batocrómico de la banda de emisión de NR en los cócteles de polimerización se atribuye a un aumento Polaridad del entorno del tinte. Tras la polimerización, el máximo de emisión de NR cambia de 637 a 610 nm para ambos tipos de micropartículas. El PLQY de las mezclas de reacción antes de la síntesis fue del 47% en ambos casos. Sin embargo, después de un tiempo de reacción de 24 h, se obtuvieron valores de PLQY del 23 % y del 55 % para las micropartículas reticuladas y no reticuladas. Después de cinco pasos de lavado, el PLQY de ambos tipos de perlas ascendió al 74%. La disminución de PLQY en comparación con NR en estireno (86%) se atribuye a un ligero aumento de la polaridad del entorno del tinte en las perlas de PS, que se sabe que reduce el PLQY de NR26,71. Esto está respaldado por los ligeros cambios batocrómicos de los espectros de emisión que se muestran en los paneles cyd de la Fig. 3.

Aunque existen varios informes sobre la preparación de perlas codificadas con QD, como se indicó anteriormente, la influencia de la reacción de polimerización y la matriz de perlas en las propiedades ópticas de los QD rara vez se han evaluado sistemáticamente, en su mayoría simplemente mediante comparación de los máximos de emisión antes. y después de la reacción3,4,11,12,13,35,38,39,40,41,42,43,48,56,57,60,61,62. Hasta ahora, solo existen dos ejemplos de estudios PLQY de QD antes y después de la incorporación de perlas, uno de Yang et al.41 sobre CdTe estabilizado con ácido 3-mercaptopropiónico en poliestireno y uno de Sheng et al.48 sobre TOP/TOPO. - CdSe/ZnCdS/ZnS estabilizado y adicionalmente recubierto de fosfina oligomérica en poliestireno. En ambos casos, se informó una pérdida significativa de PLQY tras la incorporación de QD en las microperlas41,48.

Con el objetivo de obtener perlas codificadas con QD brillantes con una pérdida mínima de fluorescencia de QD y sin fugas de QD, evaluamos y optimizamos las condiciones de la reacción de polimerización utilizando mediciones DLS, SEM y PL para el control de calidad de las perlas. Los resultados se resumen en las Figs. 4 y 5. Antes de la síntesis, se examinaron mediante TEM las propiedades ópticas y analíticas estructurales de los CdSe/CdS-QD estabilizados con ácido oleico (OA)/oleilamina (OLA), así como la espectroscopía de absorción y PL y la concentración de QD de la dispersión utilizada fue determinada por AAS (para ambos ver SI, Fig. S2). Como herramienta para la calidad de las perlas, aquí nos centramos primero en las propiedades PL de las perlas codificadas con QD, con especial énfasis en la posición espectral y el ancho espectral (FWHM: ancho completo a la mitad del máximo) de la banda de emisión QD, que se correlacionan con QD. tamaño y distribución de tamaño, y PLQY, que es independiente del tamaño del cordón y del número de QD incorporados. La caracterización analítica estructural de los diferentes tipos de perlas codificadas por QD obtenidas a partir de QD con diferentes químicas superficiales y sin y en presencia de un reticulante se detalla en la siguiente sección, evaluando así características como el tamaño de las perlas, la distribución de tamaños y la superficie. Morfología así como distribución QD dentro de las perlas.

Espectros de emisión (λexc = 350 nm) de CdSe/CdS-QD en la mezcla de reacción antes de la reacción de polimerización y las microperlas de PS codificadas con QD resultantes en etanol, obtenidas para (a) QD estabilizadas con OA/OLA, reticuladas con DVB, ( b) QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC sin reticulación, con PEG-b-PCL, (c) para condiciones optimizadas, es decir, QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC, adición de PEG-b-PCL, y reticulación con DVB, y (d) los valores PLQY correspondientes obtenidos en diferentes etapas de reacción y para los QD iniciales. Condiciones utilizadas para la preparación de las perlas de PS codificadas por QD: 75 °C, 36,6 mg de AIBN, 36,6 mg de PEG-b-PCL, velocidad de agitación de 70 rpm y tiempo de reacción de 24 h. Para la comparación de los espectros de PL, la intensidad de emisión de los QD en la mezcla de reacción inicial siempre se estableció en uno y los otros espectros se escalaron en consecuencia. El cambio observado de los máximos de emisión se atribuye al cambio en el entorno QD de inicialmente estireno/etanol a poliestireno después de la reacción de polimerización. El aumento en la intensidad de PL de las perlas en los paneles (a,c) lavados 5 veces con etanol en comparación con el PL de las perlas después de un tiempo de reacción de 24 h se atribuye a un ligero cambio en la concentración de las perlas y a la pérdida de perlas durante los pasos de lavado. como lo revelan los espectros de absorción correspondientes que se muestran en el SI (Fig. S4).

Imágenes SEM con la presentación esquemática de las microperlas codificadas con CdSe/CdS y la distribución de tamaños, sintetizadas a partir de (a) CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC y estireno (36,6 mg de AIBN, tolueno añadido sin PEG- b-PCL, 200 µL de DVB), (b) CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y estireno en presencia del copolímero PEG-b-PCL (36,6 mg de AIBN, 36,6 mg de PEG-b-PCL, 200 µL DVB), (c) CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC y estireno en presencia de PEG-b-PCL sin el reticulante DVB (100 mg de AIBN, 36,6 mg de PEG-b-PCL), y (d) CdSe/CdS-QD y estireno estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC con el procedimiento optimizado (36,6 mg de AIBN, 36,6 mg de PEG-b-PCL, 200 µL de DVB). Condiciones de reacción para todos: 75 °C, velocidad de agitación de 70 rpm, tiempo de reacción de 24 h.

En un primer intento de producir perlas codificadas con QD, se precipitaron CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y dispersos en tolueno mediante la adición de etanol, se separaron mediante centrifugación (5 min a 8000 rpm con una microcentrífuga Eppendorf 5415 D) y se redispersaron. en estireno. Como se muestra en la Fig. 4a, el máximo de emisión de QD cambia solo ligeramente de 625 a 622 nm debido al cambio en el entorno de QD y el FWHM de los espectros de PL apenas cambia para los QD incorporados en perlas. Esto indica que el tamaño QD y la distribución de tamaños no se alteran durante la reacción de polimerización. Las perlas codificadas con QD formadas, reticuladas con DVB y dispersadas en etanol muestran una disminución del 80% en comparación con la intensidad inicial antes de la síntesis y PLQY disminuyó del 28 al 13% (Fig. 4b). Después de la purificación de las perlas mediante lavado con etanol (5 ciclos de lavado-centrifugación), PLQY aumentó aproximadamente un 16% alcanzando un valor del 29%. Esto se atribuye a la presencia de QD libres, posiblemente dañados después de la preparación de las perlas, que presentan un PLQY bajo o incluso son oscuros, es decir, no emisivo y contribuyen sólo a la absorción de la dispersión, distorsionando así el PLQY resultante de la dispersión de perlas. . Estos resultados indican que bajo estas condiciones, la compatibilidad de la química de la superficie de QD con la matriz polimérica es pobre, ya que muchos QD obviamente no están incluidos en las partículas de PS formadas. Además, las condiciones de polimerización afectan claramente la fluorescencia QD, posiblemente modificando la cubierta del ligando. Las propiedades PL de las perlas sintetizadas (máximos de emisión, FWHM, PLQY) codificadas con QD, así como aquellas codificadas con NR, también se resumen en el SI (Tabla S3).

Para proteger y anclar mejor los QD en la matriz de cuentas, examinamos la influencia de un ligando de superficie adicional compatible con polímeros, aquí OBDAC, en el resultado de la reacción. Se supone que OBDAC se intercala con la capa de ligando OA/OLA inicialmente presente, actuando como un recubrimiento orgánico adicional envuelto alrededor de los QD. De este modo, se evita el intercambio y la eliminación de ligandos, lo que puede introducir estados de defecto y trampa en la superficie QD, lo que lleva a una reducción en la intensidad de PL y PLQY72. Una comparación de los espectros PL y PLQY de los QD estabilizados con OA / OLA recubiertos con OBDAC y los QD sin recubrimiento que se muestran en el SI (Fig. S2) revela la ausencia de cambios espectrales y cambios en el ancho espectral de la banda de luminiscencia QD. El PLQY cae del 72 % observado para los QD CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA en tolueno al 68 % para los QD recubiertos con OBDAC en solo un 4 %. Como se observó para el QD estabilizado con OA / OLA, el máximo de emisión de QD cambia de 627 a 624 nm para las microperlas que contienen QD recubiertos con OBDAC y FWHM apenas se vio afectado, lo que sugiere que no hay cambios en el tamaño y la distribución de tamaño del QD durante la polimerización (Fig. 4c ). Como se muestra en la Fig. 4b, los valores de PLQY de los QD en la mezcla de reacción antes del inicio de la reacción de polimerización fueron aproximadamente del 28% tanto para los QD estabilizados con OA/OLA como para los QD recubiertos adicionalmente con OBDAC. Sin embargo, en el último caso, el PLQY de las microperlas codificadas con QD resultantes alcanzó el 26% después de 24 h para los QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC, lo que excede el valor de PLQY resultante para el primero (13%) por un factor. de 2. Para las microperlas lavadas codificadas con QD estabilizadas con OA/OLA y recubiertas con OBDAC, se obtuvo un PLQY del 34 %, que es ligeramente mayor (en un 5 %) que el PLQY de las microperlas que contienen QD estabilizadas con OA/OLA .

Un desafío bien conocido que deben superar las perlas codificadas por luminóforos es la prevención de fugas de luminóforos en condiciones relevantes de aplicación, como pasos de lavado obligatorios para la purificación de perlas o la presencia de proteínas o tensioactivos como la estreptavidina que se usa a menudo para reacciones de bioconjugación. Como el lavado de las micropartículas de PS codificadas con QD con etanol conduce a una fuga de QD incluso para los QD estabilizados con OA/OLA recubiertos con OBDAC, indicados por una pérdida en la intensidad de PL, por lo tanto, hasta un 5% de DVB (refiriéndose a la cantidad de estireno usado) se añadió al cóctel de polimerización como segundo monómero para reticular la matriz de PS. Posteriormente, examinamos la influencia de la reticulación de las perlas en las características de QD PL. Los espectros de emisión de la mezcla de reacción antes de la polimerización, así como después de un tiempo de reacción de 24 h y después de cinco pasos de lavado consecutivos con etanol que se muestran en la Fig. 4d, demuestran claramente el efecto beneficioso del reticulante. Como se muestra en esta figura, el máximo de emisión de QD cambia de 627 a 624 nm debido al cambio en el entorno de QD para QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC en presencia de DVB. Las partículas sin DVB sufren una pérdida significativa en la intensidad de PL durante la formación de perlas, inhibiendo solo aproximadamente el 40% de la intensidad de PL inicial y durante los pasos de lavado, incluso disminuye a aproximadamente el 10% de la intensidad de PL inicial. La reticulación reduce considerablemente la disminución de la intensidad de PL y ayuda a prevenir fugas de QD durante la purificación de las perlas (consulte también la próxima sección). Esto último está indicado por el PL mínimo detectable en el sobrenadante de las perlas de PS codificadas con QD reticuladas y lavadas (procedimiento optimizado). Como se muestra en la Fig. 4, DVB también afecta el PLQY de los QD incorporados en las cuentas. Mientras que con valores del 31 % y 28 %, el PLQY de los QD en el cóctel de polimerización fueron muy similares sin y con reticulante, la influencia beneficiosa del DVB se hizo evidente después de la formación de las perlas. El PLQY de las perlas reticuladas alcanzó un valor del 26%, superando el PLQY de las no reticuladas del 15% por un factor de casi 2. La influencia favorable del reticulante se hizo aún más pronunciada después de cinco etapas de lavado con valores de PLQY del 34% para las reticuladas y el 15% para las no reticuladas. Aparentemente, al encapsular firmemente los QD durante la formación de perlas en una etapa temprana de la reacción, DVB no solo puede evitar las fugas de QD, sino que también evita daños a los CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC y los protege del etanol. , que puede inducir la extinción de PL, por ejemplo, mediante agregación irreversible de los QD o eliminación de ligandos de superficie.

La caracterización de las perlas codificadas con QD obtenidas con QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC, estabilizados con OA/OLA en condiciones de reacción idénticas (75 °C, 36,6 mg de AIBN, velocidad de agitación de 70 rpm) utilizando DLS y microscopía electrónica reveló una considerable diferencias en el tamaño de las cuentas. Mientras que en presencia del primero, el tamaño de la perla ascendió a 872 ± 150 nm, para el segundo se obtiene un tamaño de perla de 768 ± 57 nm (tamaños determinados a partir de imágenes SEM). Las imágenes SEM correspondientes con las distribuciones de tamaño de las cuentas se muestran en la Fig. 5.

Una comparación de las imágenes SEM de partículas de PS no reticuladas y reticuladas mostradas en la Fig. 5 revela una superficie ligeramente más rugosa de las perlas reticuladas en comparación con la superficie más suave de las perlas obtenida sin DVB. Además, la presencia de DVB aumenta el tamaño de las cuentas. Mientras que las perlas reticuladas (preparadas con 36,6 mg de AIBN) tienen un tamaño de 768 ± 57 nm, el tamaño de las perlas sin DVB, pero con 100 mg de AIBN, asciende a 1097 ± 91 nm según se determina a partir de imágenes SEM. El mayor tamaño de este último se atribuye en parte a la mayor cantidad de AIBN. Las partículas reticuladas a menudo tienden a ser más grandes que sus contrapartes no reticuladas, incluso en condiciones de reacción iguales (consulte la Fig. 3 para microperlas codificadas con NR). Esta diferencia se puede atribuir al cambio en la dinámica de reacción introducida por el reticulante, por ejemplo, al interferir con la nucleación de las partículas73. La distribución de tamaño de las perlas optimizadas codificadas con QD es muy similar a la de las perlas simples con una desviación estándar relativamente pequeña. Sin embargo, como el enfoque de nuestro estudio fue la preservación de un alto PLQY de los QD encapsulados y la prevención de fugas de QD, este aumento en el tamaño de las cuentas no fue relevante aquí. Además, para la mayoría de las aplicaciones de dichas perlas codificadas con QD, este aumento del tamaño de partícula de aproximadamente un 25 % no es importante.

La distribución QD dentro de las micropartículas de PS, que puede ser relevante, por ejemplo, para todo tipo de aplicaciones que dependen de la transferencia de energía desde los fluoróforos codificantes a los fluoróforos unidos a la superficie, se evaluó a modo de ejemplo para perlas seleccionadas codificadas con OA/OLA-recubiertas con OBDAC. CdSe/CdS-QD estabilizados utilizando STEM con EDXS y CLSM. Para obtener una visión detallada de la distribución de QD en una sola microperla, se tomaron imágenes STEM con un voltaje de aceleración de 200 kV, mientras que la distribución de Cd, Se y S que constituyen los QD del núcleo/cubierta dentro de la microperla se derivó de mediciones EDXS. Las imágenes obtenidas se muestran en la Fig. 6. La imagen STEM indica la localización de los QD en la región del núcleo de la cuenta. Esto también revela sólo muy poca aglomeración o agregación de los QD individuales dentro de la perla. Los mapas EDXS que se muestran en la Fig. 6d indican la presencia de Cd y Se en las microperlas codificadas, lo que confirma la incorporación exitosa de CdSe / CdS-QD en las perlas. En el SI se incluyen mapas EDXS adicionales de C y S (Fig. S5). Como se puede ver en la Fig. 6b, c, las imágenes CLSM de las perlas codificadas con QD respaldan que el origen de PL se origina principalmente en el núcleo de la perla. Esto resulta obvio al comparar la fluorescencia con la imagen de transmisión, donde esta última muestra partículas más grandes que las áreas brillantes en la imagen de fluorescencia. La acumulación de QD en la región central se atribuye a la hidrofobicidad de los QD estabilizados con OA/OLA recubiertos con OBDAC que, junto con la reticulación con DVB, favorece la incorporación de QD en las primeras semillas de perlas formadas desde el inicio de la reacción de nucleación. eliminándolos de este modo en la medida de lo posible de la parte etanólica de la mezcla de reacción.

Localización de los QD dentro de las microperlas de PS, determinada (a) con una imagen STEM de microperlas de PS reticuladas con DVB codificadas con CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC, que revela la ubicación de los QD en el núcleo de las microperlas región; con imágenes CLSM de las mismas partículas medidas (b) en fluorescencia y (c) en transmisión, incluida una comparación de tamaño del área fluorescente y el diámetro de partícula derivado de la imagen de transmisión y (d) con análisis EDXS de las mismas partículas reticuladas con DVB Microperlas de PS codificadas con CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC. Condiciones de reacción de las partículas en todas las imágenes: 75 °C, 36,6 mg de AIBN, 36,6 mg de PEG-b-PCL, velocidad de agitación de 70 rpm, tiempo de reacción de 24 h.

Para investigar más a fondo la estabilidad del tinte y la codificación QD, las perlas codificadas preparadas y purificadas de manera diferente se incubaron en diferentes medios (agua MilliQ, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) durante una hora a 37 ºC. Luego, las perlas se separaron con unidades de filtro centrífugo (10 kDa, Amicon Ultra, Merck Millipore) y se determinó fotométricamente la cantidad de moléculas de tinte liberadas o QD en el sobrenadante. Los resultados de los estudios de fugas se muestran en el SI (Fig. S6). Estos experimentos revelaron una alta estabilidad de fuga de las moléculas NR y QD en las microperlas, ya que la cantidad detectada de compuesto luminiscente estaba muy por debajo del 1% en la mayoría de los casos. Para las microperlas reticuladas DVB con CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC, la cantidad de QD libres fue inferior al 1% para el agua MilliQ y PBS, y por debajo del 2% para DMEM. Lo mismo se aplica a la cantidad de colorante libre para microperlas reticuladas DVB con NR. Para las perlas codificadas con NR sin reticulación, se pudo detectar menos del 1% de tinte libre para los tres medios. Para CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC, la liberación de QD de las microperlas preparadas sin DVB fue inferior al 1% en agua MilliQ y DMEM, y aproximadamente al 1% para PSB. Estos resultados confirman la excelente estabilidad a las fugas de nuestras perlas codificadas en NR y QD.

La fotoestabilidad a corto plazo de las microperlas codificadas en NR y QD se evaluó con el CLSM. La estabilidad a largo plazo se estimó con un simulador de luz solar, en este caso también en comparación con el colorante NR y los QD. Los datos correspondientes se muestran en el SI (ver Fig. S7).

Las mediciones CLSM a corto plazo revelaron una disminución aproximadamente exponencial de la intensidad de luminiscencia de las perlas codificadas con NR y una disminución casi lineal para las perlas codificadas con QD. Después de 20 escaneos, correspondientes a aproximadamente 42 s, las perlas codificadas con NR quedaron con aproximadamente el 48% de su intensidad de luminiscencia inicial, mientras que las perlas codificadas con QD conservaron el 67%. de su luminiscencia inicial.

Como se esperaba, las perlas codificadas con NR mostraron una fotoestabilidad muy limitada con una pérdida significativa de luminiscencia incluso después de cortos intervalos de exposición a la luz. Sin embargo, las perlas codificadas con NR todavía muestran una luminiscencia después de 24 h de iluminación con una densidad de potencia de 650 W/m2 en el simulador de luz solar, aunque una luminiscencia restante mucho menor que las perlas codificadas con QD. Después de la iluminación durante 72 h, las perlas codificadas por NR muestran una pérdida más o menos completa de luminiscencia después de 72 h, mientras que las perlas codificadas por QD siguen siendo luminiscentes después de 120 h de exposición a la luz.

Posteriormente, realizamos estudios de detección de la capacidad de ajuste del tamaño de las microperlas de polímero codificadas con CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC utilizando nuestro procedimiento de polimerización para evaluar su flexibilidad e identificar los parámetros más relevantes para el control del tamaño de las perlas. Por lo tanto, se variaron diferentes parámetros de la reacción de polimerización previamente optimizada y se determinó el tamaño de las perlas resultantes con DLS. Los parámetros evaluados incluyeron temperatura (varió entre 60 y 80 °C), velocidad de agitación (50 a 250 rpm), tiempo de reacción (0,5 a 24 h) y cantidad de AIBN (36,6 a 200 mg), que se modificaron manteniendo otras condiciones de síntesis. constante. Como se muestra en la Fig. 7, panel a, un factor importante con una influencia considerable en el tamaño de las partículas es la temperatura de reacción, cuyo aumento conduce a una disminución en el tamaño de las perlas. Esto se atribuye a un mayor número de semillas formadas simultáneamente a altas temperaturas, lo que automáticamente da como resultado un tamaño de partícula más pequeño. Las microperlas formadas a una temperatura de reacción de 60 °C son relativamente pequeñas y la dispersión de perlas resultante tiene una concentración de perlas baja, lo que indica que la reacción de polimerización se ralentiza significativamente y es incompleta a esta temperatura. Como se muestra en el panel b de la Fig. 7, un aumento en la velocidad de agitación favorece la formación de microperlas más pequeñas al disminuir el tamaño de las micelas de PVP en las que crecen las perlas de polímero. La dependencia del tiempo del comportamiento de crecimiento de las perlas que se muestra en la Fig. 7c indica que para tiempos de reacción de hasta cuatro horas, el tamaño de las partículas aumenta rápida y casi linealmente. Entonces, la velocidad de crecimiento se ralentiza significativamente. Además, la cantidad del iniciador radical AIBN puede afectar el tamaño de las microperlas (Fig. 7d). Como era de esperar, el uso de una mayor cantidad de AIBN y, por tanto, la presencia de un mayor número de radicales, acelera la reacción de polimerización y proporciona perlas más grandes. Sin embargo, una cantidad de AIBN superior a 200 mg provoca la agregación de microperlas durante la reacción de polimerización.

Tamaño de partícula de microperlas de PS reticuladas con DVB codificadas con CdSe/CdS-QD estabilizadas con OA/OLA y recubiertas con OBDAC, determinadas por DLS, obtenidas en función de (a) temperatura de reacción sistemáticamente variada, (b) velocidad de agitación, ( c) tiempo de reacción (muestras no purificadas), y (d) cantidad de AIBN. En todos los casos, se utilizaron 36,6 mg de PEG-b-PCL en tolueno y la misma cantidad de CdSe/CdS-QD estabilizados con OA/OLA y recubiertos con OBDAC.

En este trabajo, desarrollamos procedimientos optimizados para la codificación de microperlas de polímero con tintes orgánicos hidrofóbicos y puntos cuánticos semiconductores (QD) agregados durante la polimerización de manera representativa para Nile Red (NR) y CdSe/CdS QD estabilizados con ácido oleico (OA) y oleilamina (OLA). Se dedicó especial énfasis a la preservación de la fotoluminiscencia inicial (PL) del QD durante la síntesis de perlas y se utilizó para optimizar la preparación de las perlas codificadas por QD, lo que rara vez se había evaluado sistemáticamente antes. Esto también proporciona una visión más profunda de cómo la reacción de formación de perlas y algunos de sus parámetros influyen en la luminiscencia QD. Mediante un ajuste cuidadoso de los parámetros, se podría lograr la síntesis de microperlas luminiscentes con una distribución de tamaño estrecha y propiedades de emisión estables, así como un rendimiento cuántico de fotoluminiscencia (PLQY) relativamente alto, aunque el PLQY aún es reducido en comparación con el PLQY inicial de los QD. Se logró una minimización de la pérdida de PLQY para los QD incorporados en perlas mediante el uso del ligando cloruro de bencildimetiloctadecilamonio, que se envolvió alrededor de los QD, lo que hizo que la química de la superficie del QD fuera más compatible con la matriz polimérica y el reticulante divinilbenceno (DVB) para evitar fugas de QD. .

El enfoque de polimerización en dispersión optimizado desarrollado es simple y allana el camino para el uso fácil y la combinación de diferentes materiales, como QD con diferentes composiciones, tintes u otros nanocristales luminiscentes como materiales codificantes para las microperlas que luego pueden emplearse para la multiplexación óptica y la combinación. con nanopartículas magnéticas, por ejemplo, para inmunoseparación. Al introducir grupos funcionales en la superficie de las microperlas durante la síntesis de las mismas, se pueden crear partículas con diferentes químicas superficiales, lo que permite pasos de procesamiento adicionales, como reacciones de bioconjugación. En el futuro, planeamos ampliar estos estudios sobre la influencia de la reacción de polimerización y la incorporación de perlas en las propiedades de luminiscencia de los nanocristales a QD con químicas de superficie sistemáticamente variadas, incluida la naturaleza química y el espesor de la capa de pasivación de la superficie, la química de la superficie de QD y morfología. Estas perlas codificadas luego se emplearán para estudios de seguimiento sobre posibles aplicaciones, como bioensayos multiplexados.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria) o están disponibles previa solicitud.

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Agradecemos a A. Feldhoff del Instituto de Química Física y Electroquímica de la Universidad Leibniz de Hannover por proporcionar las instalaciones de TEM y al Dr. A. Schaefer del Instituto de Química y Bioquímica de la Universidad Libre de Berlín por proporcionar las instalaciones de RMN respaldadas por DFG. Además, agradecemos al Dr. KD Wegner de la División Biofotónica del BAM por las fructíferas discusiones y al Dr. Thomas Thiele, PolyAn GmbH Berlin, por la lectura crítica del manuscrito.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. L. Scholtz agradece la financiación del Programa Europeo de Metrología para la Innovación y la Investigación (EMPIR) en el marco del proyecto “AeroTox” de la convocatoria de salud (18HLT02). La iniciativa EMPIR está cofinanciada por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea y por los estados participantes de EMPIR. JG Eckert agradece la financiación de la MWK (Escuela de Fabricación Aditiva SAM). NC Bigall y F. Lübkemann reconocen la financiación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania dentro del Clúster de Excelencia PhoenixD (EXC 2122, ID de proyecto 390833453). O. Hübner agradece la financiación del proyecto ERA.Net Rus TARQUS.

División 1.2 Biofotónica, Instituto Federal de Investigación y Ensayo de Materiales (BAM), Richard-Willstätter-Str. 11, 12489, Berlín, Alemania

Lena Scholtz, Oskar Hübner y Ute Resch-Genger

Instituto de Química y Bioquímica, Universidad Libre de Berlín, Takustr. 3, 14195, Berlín, Alemania

Lena Scholtz, Toufiq Elahi y Oscar Hubner

Instituto de Química Física y Electroquímica, Leibniz Universität Hannover, Callinstraße 3A, 30167, Hannover, Alemania

J. Gerrit Eckert, Franziska Lübkemann y Nadja C. Bigall

Clúster de Excelencia PhoenixD (Fotónica, Óptica e Ingeniería-Innovación entre Disciplinas), 30167, Hannover, Alemania

Franziska Lübkemann y Nadja C. Bigall

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LS planificó y llevó a cabo las síntesis, excepto los experimentos que contribuyeron a la selección de las condiciones de reacción de la reacción de polimerización y la sintonizabilidad del tamaño de las perlas en el ms (Fig. 7) que fueron llevados a cabo por TE. Las mediciones fueron planificadas por LS y realizadas por JGE (SEM, AAS), FL (STEM), OH (CLSM) y LS (DLS, toda espectroscopía de fluorescencia y absorción), todos los autores enumerados también ayudaron a interpretar los datos. LS escribió el manuscrito con importante ayuda de UR-G. y NCB Todos los autores participaron en la discusión de los resultados, así como en la corrección, revisión y edición, y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ute Resch-Genger.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Scholtz, L., Eckert, JG, Elahi, T. et al. Codificación de luminiscencia de microperlas poliméricas con tintes orgánicos y puntos cuánticos semiconductores durante la polimerización. Informe científico 12, 12061 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16065-x

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Recibido: 18 de abril de 2022

Aceptado: 04 de julio de 2022

Publicado: 14 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16065-x

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