La nueva tecnología de cuentas permite el comercio

Las perlas de cromatografía de afinidad diseñadas específicamente para ARNm y FPLC eliminan sustancias químicas tóxicas y purifican decenas de gramos, eliminando un cuello de botella clave.

Antes de que se puedan producir terapias basadas en ARNm en cantidades adecuadas para ensayos clínicos y distribución comercial, será necesario eliminar un cuello de botella clave: la purificación del ARNm. Los métodos existentes normalmente purifican sólo unos pocos gramos de ARNm, no las decenas de gramos o incluso las decenas de kilogramos necesarios. Para mejorar la purificación del ARNm, Thermo Fisher ha desarrollado la resina de afinidad POROS Oligo (dT)25. A diferencia de los enfoques de purificación alternativos, la cromatografía con una resina a base de perlas tiene una excelente escalabilidad. En particular, la resina captura selectivamente el ARNm a través de la cola poliadenilada mediante sencillos pasos de purificación con agua y sal. [Artur Plawgo/Getty Images]

Las terapias basadas en ARNm se catapultaron a la vanguardia de la conciencia pública en forma de vacunas contra el virus SARS-CoV-2. Después de ese éxito, ahora se están desarrollando terapias de ARNm para un número cada vez mayor de indicaciones y aplicaciones que incluyen cáncer, fibrosis quística y enfermedades infecciosas, así como terapias genéticas y con células madre basadas en el reemplazo o la edición de genes.

Sin embargo, el cuello de botella de la purificación debe resolverse antes de que estas terapias puedan ampliarse y producirse en cantidades adecuadas para ensayos clínicos o comercialización.

"Tradicionalmente, se han utilizado herramientas y productos a pequeña escala para purificar el ARNm, como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa, la precipitación y, en algunos casos, la cromatografía basada en celulosa", dice Sirat Sikka, científico de aplicaciones de campo. en Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher). Esos métodos se pueden utilizar para purificar unos pocos gramos de ARNm y son adecuados para trabajos de laboratorio y algunas aplicaciones. Sin embargo, la ampliación para ensayos clínicos y comercialización requiere la capacidad de purificar decenas de gramos o incluso decenas de kilogramos de ARNm.

"En Thermo Fisher, entendimos la importancia del ARNm y sabíamos, incluso antes de la pandemia, que el ARNm se utilizaría ampliamente", recuerda Sikka. Desde entonces, tanto las revistas científicas como las comerciales han citado las terapias y vacunas de ARNm como avances disruptivos que pueden cambiar el futuro de la medicina y la facilidad de fabricación, y la capacidad de atacar vías que de otro modo no serían farmacológicas. El analista de la industria Research and Markets predice que el segmento global de terapias de ARNm crecerá de 46.700 millones de dólares en 2021 a 101.300 millones de dólares en 2026. Esa es una tasa de crecimiento anual compuesta del 16,8%.

Para estar preparado para un crecimiento tan rápido en el desarrollo de ARNm, Thermo Fisher comenzó a desarrollar una nueva resina de cromatografía de afinidad para aislar y purificar ARNm mucho antes de que la tecnología se convirtiera en una "palabra familiar". El equipo buscó desarrollar una resina que permitiera una mejor recuperación, una mayor pureza y una mayor reproducibilidad.

La resina de afinidad POROS™ Oligo (dT)25, el producto resultante, es una perla porosa reticulada de poli(estireno-co-divinilbenceno) de 50 µm funcionalizada con hebras de desoxitimidina (dT) que se unen al ARNm a través de la cola poli-A ( una cadena de nucleótidos de adenina) que se encuentra en el extremo triple de todas las moléculas de ARNm.

Uno de los desafíos es el tamaño del ARNm. Es una molécula grande (de 20 a 50 nm o más de tamaño que varía según la longitud de la construcción y la composición de la solución), por lo que puede haber una limitación en la difusión a través de los medios de cromatografía y, por lo tanto, un obstáculo para la transferencia de masa, explica Sikka. Debido a que las perlas POROS™ tienen poros pasantes grandes, el área de superficie disponible para la interacción entre la resina y la molécula de ARNm aumenta, lo que conduce a una mayor capacidad. Los poros grandes también dan como resultado una resistencia reducida a la transferencia de masa, lo que ayuda a mejorar la eficiencia y la productividad del proceso.

"La resina de afinidad POROS Oligo (dT)25 minimiza la necesidad de trabajar con disolventes orgánicos que se utilizan a menudo con sistemas HPLC", continúa Sikka. "El uso de disolventes orgánicos en grandes volúmenes se convierte en un problema para la fabricación". Ella cita preocupaciones de seguridad con respecto a la eliminación de solventes, así como la necesidad de modernizar las instalaciones para lidiar con ellos.

En lugar de utilizar productos químicos tóxicos, después de la síntesis de ARNm, la columna se carga "con ARNm más sal (por ejemplo, NaCl)". Esto neutraliza las cargas negativas de las moléculas de ARN para que la cola poli-A pueda unirse con las hebras dT de las perlas. Luego, dice, "la elución se puede realizar utilizando un tampón de baja conductividad o incluso agua en algunos casos". Las impurezas y los iones de sal se eliminan por lavado. Una vez eliminado el sodio, las cargas negativas de poli-dT y la cola de poli-A se repelen entre sí, liberando el ARNm purificado y generando una recuperación, normalmente superior al 90 %, dependiendo del tampón de elución y del tamaño de la construcción de ARNm.

La resina de afinidad POROS Oligo (dT)25 está diseñada para procesos de purificación escalables, por lo que se utiliza para empaquetar columnas de cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC). "Las columnas se pueden empaquetar en varios tamaños de columna según las necesidades de los clientes, en función del desarrollo y la optimización de sus procesos", afirma Sikka. “También tenemos columnas preempaquetadas de pequeño volumen y Robocolumns. Las columnas preempaquetadas de 1 ml y 5 ml podrían usarse con HPLC si fuera necesario, pero eso solo permitiría a los clientes purificar volúmenes de muestra muy pequeños, puede requerir reinstalación y generalmente no es ideal para el desarrollo de procesos, por lo que se prefiere cambiar a FPLC. Lo que los clientes buscan principalmente cuando eligen esta resina es aumentar la purificación, por lo que la utilizan con sistemas FPLC”.

Sikka dice que esta resina de afinidad es una buena opción para los científicos interesados ​​en desarrollar un proceso de plataforma que pueda implementarse para una variedad de construcciones de ARNm. Uno de los beneficios de usar ARNm es que la misma estructura estructural podría usarse para expresar diferentes proteínas. Como resultado, los científicos pueden utilizar potencialmente un proceso de plataforma para múltiples programas de ARNm.

Si bien los investigadores pueden cambiar el gen de interés, "todavía podrían estar trabajando con ARNm de tamaños comparables", explica Sikka. "Por ejemplo, dependiendo de la proteína que estén tratando de expresar, si el rango de tamaño de todas las construcciones está entre 4000 y 6000 bases, podrían usar esto como el primer paso de captura y desarrollar un proceso de plataforma". Trabajar con ARNm mucho más grande, como el autoamplificado, podría requerir algún desarrollo adicional.

Como tecnología de plataforma, el primer paso de purificación con POROS Oligo (dT)25 eliminaría la plantilla de ADN digerido, los nucleótidos, las enzimas y los componentes del tampón. Este podría ser el único paso del proceso antes de la concentración y el intercambio de buffer. Si es necesario, se puede desarrollar un segundo paso de cromatografía con resinas de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) o cromatografía de intercambio aniónico (AEX) POROS™ para eliminar el ARN bicatenario y las transcripciones de ARN incompletas sin tapar o residuales.

"Comenzar con esta resina durante la fase de investigación y descubrimiento permite a los científicos continuar usando la misma resina de purificación hasta llegar a la fabricación comercial", afirma. "Esto también facilita el proceso de transición de una construcción de ARNm a otra de tamaño similar".

Como ella explica, "una vez utilizada en un proceso, la resina ya está en el sistema y es aceptada por el equipo de calidad del cliente". Además, los científicos no necesitan volver a desarrollar sus pasos de purificación durante cada fase de ampliación, lo que minimiza la necesidad de incorporar una variedad de productos químicos y soluciones o desarrollar diferentes composiciones de tampón, lo que acelera el desarrollo del proceso y reduce el tiempo de comercialización. Las resinas también son reutilizables, lo que reduce el coste de los bienes.

"Es importante destacar que las perlas de resina POROS Oligo (dT)25 Affinity están disponibles para la producción GMP y proporcionamos el paquete de soporte regulatorio", dice Sikka.

Cambiar a POROS Oligo (dT)25 Affinity Resin es solo una cuestión de pedir las columnas preempaquetadas si los clientes ya utilizan FPLC.

"Sin embargo, muchos de nuestros clientes todavía están en la escala de investigación y están interesados ​​en ampliarla", señala Sikka. "No necesariamente tienen sistemas FPLC y están tratando de comprender sus opciones".

En esos casos, recomienda pedir la resina POROS Oligo (dT)25Affinity suelta, que se puede utilizar en columnas de centrifugación o tubos de microcentrífuga en modo por lotes. Si eso funciona bien para sus propósitos, podrían considerar invertir en un FPLC para una mayor optimización y ampliación de la purificación.

"Thermo Fisher está muy centrado en la actualidad", afirma Sikka, con soluciones que abordan los desafíos de purificación actuales y emergentes. Hoy en día, eso significa centrarse intensamente en la purificación del ARNm.

A medida que el interés en la terapia con ARNm continúa aumentando, la investigación y el desarrollo de la compañía se centran en comprender la complejidad asociada con la purificación del ARNm autoamplificador, la eliminación de impurezas relacionadas con el producto, como el ARN bicatenario y las transcripciones abortivas, y el uso de POROS Oligo (dT)25 Affinity. Resina y otras tecnologías para resolver desafíos existentes y emergentes.